谱系示踪核心定义：利用某种标记技术，对生物体内的特定祖细胞（祖先细胞）进行永久性标记，随后在其正常发育、衰老或疾病过程中，追踪这些被标记细胞的所有后代细胞的最终去向、分化命运和空间分布。这项技术是发育生物学、干细胞生物学和肿瘤生物学等领域回答一些根本性的问题不可或缺的工具。

随着科学技术的发展，将荧光染料直接注射到细胞或胚胎中或是用逆转录病毒等将报告基因随机整合到细胞基因组中等方法已被现代金标准：基于遗传的谱系示踪系统所取代。这是目前最主流、最可靠的方法，其核心是“Cre-loxP重组酶系统”。

Cre-loxP重组酶系统核心原理

Cre酶：一种能识别特定DNA序列（loxP位点）并将其切除或重组的酶。

报告基因：一个原本不表达的荧光蛋白基因（如GFP、tdTomato），因为它前面有一个被“终止序列”（Stop）挡住的“开关”。

如何工作：当细胞表达Cre酶时，它会将“终止序列”切除，从而永久性地打开报告基因的“开关”。一旦开关被打开，这个细胞及其所有的后代细胞都会持续表达荧光蛋白，就像盖上了永久的家族印章。

关键技术突破：诱导型谱系示踪

普通的Cre酶一直有活性，无法控制标记时间。科学家将Cre酶与一个突变版的雌激素受体（ER）融合，创造了CreER。CreER平时在细胞质中，不进入细胞核。只有当给予外源药物（如他莫昔芬Tamoxifen）时，CreER才会进入细胞核工作。

优势：实现了时间特异性标记。可以在想要的任何时间点（例如，胚胎第10天，或成年后），通过给药来“启动”标记，极大地提高了实验的精确度。

图1 Cre-loxP重组酶系统工作示意图

进阶技术：双重组酶系统

当研究的问题变得更复杂时，单一的Cre系统就显得不够用了。例如，想精确标记只同时表达A和B两种蛋白的细胞，或者想捕捉一个瞬时变化的细胞状态（如EMT）。这时，就需要双重组酶系统登场。

组成：在Cre-loxP系统的基础上，引入第二套重组酶系统，如Dre-rox。

核心思想：只有当两种重组酶同时在一个细胞中起作用时，报告基因才会被激活或改变，从而实现“逻辑门”式的精准控制。

双重组酶系统的三大核心优势

精准标记“双阳性”细胞

利用CreXER、DreXER等改造型重组酶，结合交叉报告系统，只有当两种重组酶（如Cre+Dre）同时存在时，才会激活报告基因，完美标记A+B+细胞群体。

图2 交叉报告系统工作示意图

只有Cre（由A驱动）和Dre（由B驱动）同时存在，报告基因才表达荧光。A-B-细胞未被染色；A+B-细胞未被染色；A-B+细胞未被染色；A+B+细胞中Cre酶会切除两个loxP位点之间的序列，Cre酶介导重组并将ER去除，Dre即可正常发挥功能切除两个Rox位点之间的序列，表达红色荧光tdTomato。

时序性追踪细胞命运

通过诱导型重组酶（CreER/DreER）与嵌套报告系统联用，可区分不同时间点表达的基因，捕捉细胞状态的动态变化。

图3 嵌套报告系统工作示意图

首先由CreER（在时间点1诱导）将细胞标记为绿色。随后，如果该细胞在时间点2表达了B基因（驱动DreER），DreER会被诱导并将报告基因从绿色切换为红色。这可以清晰地展示细胞命运的动态变化。A+B-细胞中Cre酶会切除两个loxP位点之间的序列，表达绿色荧光ZsGreen；A+B+细胞和A-B+细胞中Dre酶会切除两个Rox位点之间的序列，表达红色荧光tdTomato。

排除异位表达干扰

使用独家报告系统，可有效避免非特异性标记，提高实验可信度。

图4 独家报告系统工作示意图

A-Cre先表达时：A+细胞中Cre酶会切除两个loxP位点之间的序列，表达绿色荧光ZsGreen；A-细胞未被染色。使用Tamoxifen诱导B-DreERT2后：A+细胞只表达绿色荧光ZsGreen；A-B+细胞中Dre酶会切除两个Rox位点之间的序列，表达红色荧光tdTomato；A-B-细胞未被染色。

如何设计双重组酶实验？

谱系示踪技术已经从最初的“粗略跟踪”发展到如今的“精准定位”。特别是双重组酶系统为我们提供了一把强大的“时空密钥”，使得在复杂的活体生物中，以极高的时空分辨率解密细胞的生命轨迹成为可能，极大地推动了对生命奥秘和疾病机制的深入理解。

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